फास्टकिंग जीडीएनए डिस्पेलिंग आरटी सुपरमिक्स

A-1 RNA अवक्रमित होता है

——बिना किसी संदूषण के उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को शुद्ध करें। जिस सामग्री से आरएनए निकाला जाता है वह आरएनए क्षरण को रोकने के लिए यथासंभव ताजा होना चाहिए। आरटी प्रतिक्रिया से पहले विकृत जेल पर आरएनए अखंडता का विश्लेषण करें। आरएनए निष्कर्षण के बाद, इसे 100% फॉर्मामाइड में संग्रहित किया जाना चाहिए। यदि RNase अवरोधक का उपयोग किया जाता है, तो ताप तापमान <45°C होना चाहिए, और pH 8.0 से कम होना चाहिए, अन्यथा अवरोधक सभी बाध्य RNase को छोड़ देगा। इसके अलावा, RNase अवरोधक को ०.८ mM DTT युक्त समाधानों में जोड़ा जाना चाहिए।

A-2 RNA में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रियाओं के अवरोधक होते हैं

——रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन इनहिबिटर में एसडीएस, ईडीटीए, ग्लिसरॉल, सोडियम पाइरोफॉस्फेट, स्पर्मिडाइन, फॉर्मामाइड, गुआनिडाइन सॉल्ट आदि शामिल हैं। सैंपल के साथ कंट्रोल आरएनए को मिलाएं, और कंट्रोल आरएनए रिएक्शन के साथ यील्ड की तुलना करें ताकि यह जांचा जा सके कि कोई इनहिबिटर है या नहीं। अवरोधकों को हटाने के लिए ७०% (v/v) इथेनॉल के साथ आरएनए वर्षा को धो लें ।

A-3 सीडीएनए के पहले स्ट्रैंड को संश्लेषित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों की अपर्याप्त एनीलिंग

——निर्धारित करें कि प्रयोग में प्रयुक्त प्राइमरों के लिए एनीलिंग तापमान उपयुक्त है। यादृच्छिक हेक्सामर्स के लिए, प्रतिक्रिया तापमान तक पहुंचने से पहले तापमान को 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर रखने की सिफारिश की जाती है। जीन-विशिष्ट प्राइमरों (जीएसपी) के लिए, अन्य जीएसपी आज़माएं, या ओलिगो (डीटी) या यादृच्छिक हेक्सामर पर स्विच करें।

ए-4 आरएनए शुरू करने की छोटी मात्रा

——आरएनए की मात्रा बढ़ाएँ। ५० एनजी से कम आरएनए नमूनों के लिए, पहले स्ट्रैंड सीडीएनए संश्लेषण में ०.१ μg से ०.५ μg एसिटाइल बीएसए का उपयोग किया जा सकता है

A-5 लक्ष्य अनुक्रम विश्लेषण किए गए ऊतकों में व्यक्त नहीं किया जाता है।

——अन्य ऊतकों को आजमाएं।

ए-6 पीसीआर प्रतिक्रिया विफल हो जाती है

——दो-चरण आरटी-पीसीआर के लिए, पीसीआर चरण में सीडीएनए टेम्पलेट प्रतिक्रिया मात्रा के १/५ से अधिक नहीं हो सकता है।

A-1 प्राइमरों और टेम्प्लेट की गैर-विशिष्ट एनीलिंग

——प्राइमरों के 3'-छोर में 2-3 dG या dC नहीं होना चाहिए। यादृच्छिक प्राइमरों या ओलिगो (डीटी) के बजाय पहले स्ट्रैंड संश्लेषण में जीन-विशिष्ट प्राइमरों का प्रयोग करें। पहले कुछ चक्रों में उच्च एनीलिंग तापमान और फिर कम एनीलिंग तापमान का उपयोग करें। प्रतिक्रिया की विशिष्टता में सुधार के लिए पीसीआर के लिए हॉट-स्टार्ट टाक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें।

A-2 जीन-विशिष्ट प्राइमरों का खराब डिज़ाइन

——प्रवर्धन प्राइमर डिजाइन के लिए समान सिद्धांतों का पालन करें।

ए-3 आरएनए जीनोमिक डीएनए से दूषित

—— पीसीआर-ग्रेड DNase I के साथ RNA का इलाज करें। डीएनए संदूषण का पता लगाने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बिना एक नियंत्रण प्रतिक्रिया सेट करें।

A-4 प्राइमर डिमर का बनना

——3' छोर पर पूरक दृश्यों के बिना प्राइमरों को डिज़ाइन करें।

A-5 बहुत अधिक Mg²⁺ एकाग्रता

—— Mg . ऑप्टिमाइज़ करें²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट और प्राइमर संयोजन के लिए एकाग्रता

ए-6 विदेशी डीएनए से दूषित

——एरोसोल प्रतिरोधी युक्तियों और यूडीजी एंजाइमों का प्रयोग करें।

ए-1 पहले स्ट्रैंड उत्पाद की सामग्री बहुत अधिक है

——पारंपरिक पीसीआर प्रतिक्रिया चरण में पहले स्ट्रैंड उत्पाद की मात्रा कम करें।

ए-2 पीसीआर प्रतिक्रिया में बहुत अधिक प्राइमर राशि

——प्राइमर इनपुट कम करें।

ए-3 बहुत अधिक चक्र

——पीसीआर प्रतिक्रिया की स्थिति को अनुकूलित करें और पीसीआर चक्र संख्या को कम करें।

ए -4 बहुत कम एनीलिंग तापमान

——गैर-विशिष्ट दीक्षा और विस्तार को रोकने के लिए एनीलिंग तापमान बढ़ाएं।

A-5 डीएनए के DNase अवक्रमण द्वारा उत्पन्न ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड अंशों का गैर-विशिष्ट प्रवर्धन ——डीएनए संदूषण को रोकने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले RNA को निकालें।

आरटी-पीसीआर आरएनए को सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्राइब करना है, और फिर लक्ष्य खंड को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए एक टेम्पलेट के रूप में रिवर्स ट्रांसकोड सीडीएनए का उपयोग करना है। प्रयोग की विशिष्ट स्थितियों के अनुसार या तो यादृच्छिक प्राइमर, ओलिगो डीटी और जीन विशिष्ट प्राइमर चुनें। उपरोक्त सभी प्राइमरों का उपयोग हेयरपिन संरचना के बिना लघु यूकेरियोटिक सेल mRNA के लिए किया जा सकता है।

रैंडम प्राइमर: हेयरपिन संरचना के साथ लंबे आरएनए के लिए उपयुक्त, साथ ही सभी प्रकार के आरएनए जैसे आरआरएनए, एमआरएनए, टीआरएनए, आदि। वे मुख्य रूप से एकल टेम्पलेट की आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए उपयोग किए जाते हैं।

ओलिगो डीटी: पॉलीए टेलिंग के साथ आरएनए के लिए उपयुक्त (प्रोकैरियोटिक आरएनए, यूकेरियोटिक ओलिगो डीटी आरआरएनए और टीआरएनए में पॉलीए पूंछ नहीं है)। चूंकि ओलिगो डीटी पॉलीए पूंछ से जुड़ा हुआ है, आरएनए नमूनों की गुणवत्ता उच्च होने की आवश्यकता है, और यहां तक ​​​​कि थोड़ी मात्रा में गिरावट भी पूर्ण-लंबाई वाले सीडीएनए संश्लेषण की मात्रा को बहुत कम कर देगी।

जीन-विशिष्ट प्राइमर: टेम्प्लेट अनुक्रम के पूरक, उन स्थितियों के लिए उपयुक्त जहां लक्ष्य अनुक्रम ज्ञात है।

दो तरीके हैं:

1. आंतरिक संदर्भ विधि: सिद्धांत रूप में, सीडीएनए विभिन्न लंबाई के डीएनए टुकड़े हैं, इसलिए वैद्युतकणसंचलन का परिणाम स्मीयर है। यदि आरएनए बहुतायत कम है, तो वैद्युतकणसंचलन में कोई उत्पाद नहीं दिखाई देगा, लेकिन इसका मतलब यह नहीं है कि पीसीआर द्वारा कोई उत्पाद नहीं बढ़ाया जाएगा। सामान्य तौर पर, सीडीएनए का पता लगाने के लिए आंतरिक संदर्भ का उपयोग किया जा सकता है। यदि आंतरिक संदर्भ के परिणाम हैं, तो सीडीएनए की गुणवत्ता की मूल रूप से गारंटी दी जा सकती है (कुछ मामलों में, यदि लक्ष्य जीन खंड बहुत लंबा है, तो अपवाद हो सकते हैं)।

2. यदि इस टेम्पलेट द्वारा प्रवर्धित कोई ज्ञात जीन है, तो इसे इस जीन के प्राइमरों द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। आंतरिक संदर्भ के प्रवर्धन का अर्थ यह नहीं है कि सीडीएनए में कोई समस्या नहीं है। क्योंकि आंतरिक संदर्भ में सीडीएनए की प्रचुरता है, इसे बढ़ाना आसान है। यदि सीडीएनए को विभिन्न कारणों से आंशिक रूप से अवक्रमित किया जाता है, तो संभाव्यता के दृष्टिकोण से, कम बहुतायत लक्ष्य जीन के पीसीआर परिणाम बहुत प्रभावित होंगे। जबकि आंतरिक संदर्भ अभी भी प्रचुर मात्रा में है, प्रवर्धन शायद प्रभावित नहीं होगा।

आरएनए का आंशिक रूप से अवक्रमण। आरएनए की अखंडता का पता लगाएं और शुद्ध करें

विभिन्न प्रजातियों की आरएनए सामग्री भिन्न हो सकती है, लेकिन सामान्य तौर पर, निकाले गए कुल आरएनए में जेल वैद्युतकणसंचलन में दो स्पष्ट 28S और 18S बैंड होने चाहिए, और पूर्व बैंड की चमक बाद की तुलना में दोगुनी होनी चाहिए। 5S बैंड इंगित करता है कि RNA अवक्रमित हो गया है, और इसकी चमक गिरावट की डिग्री के समानुपाती है। आंतरिक संदर्भ के सफल प्रवर्धन का मतलब यह नहीं है कि आरएनए के साथ कोई समस्या नहीं है, क्योंकि आंतरिक संदर्भ उच्च बहुतायत में है, आरएनए को तब तक बढ़ाया जा सकता है जब तक कि गिरावट गंभीर न हो। OD₂₆₀/ओडी₂₈₀स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा मापा गया शुद्ध आरएनए का अनुपात 1.9 और 2.1 के बीच होना चाहिए। आरएनए में प्रोटीन अशुद्धता की थोड़ी मात्रा अनुपात को कम कर देगी। जब तक मान बहुत कम नहीं है, RT प्रभावित नहीं होगा। आरटी के लिए जो सबसे ज्यादा मायने रखता है वह है आरएनए अखंडता।

आंतरिक संदर्भ जीन का विस्तार केवल यह संकेत दे सकता है कि आरटी सफल हो गया है, लेकिन यह जरूरी नहीं कि सीडीएनए स्ट्रैंड की गुणवत्ता से संबंधित हो। चूंकि आंतरिक संदर्भ अंश आमतौर पर आकार में छोटे और अभिव्यक्ति में उच्च होते हैं, इसलिए वे रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में सफल होना आसान होते हैं। हालांकि, लक्ष्य जीन का आकार और अभिव्यक्ति एक जीन से दूसरे जीन में भिन्न होती है। सीडीएनए गुणवत्ता को केवल आंतरिक संदर्भ से नहीं आंका जा सकता है, विशेष रूप से 2 kb से अधिक के लक्ष्य अंशों के लिए।

कुछ नमूनों में जटिल माध्यमिक संरचनाएं होती हैं, या समृद्ध जीसी सामग्री होती है, या कम बहुतायत के साथ कीमती होती है। इन मामलों में, लक्ष्य के टुकड़े और नमूने के आकार के अनुसार उपयुक्त रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का चयन किया जाना चाहिए। उच्च जीसी सामग्री और जटिल माध्यमिक संरचना वाले आरएनए टेम्पलेट्स के लिए, माध्यमिक संरचना को कम तापमान पर, या सामान्य रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के साथ खोलना मुश्किल है। इन टेम्प्लेट के लिए, क्वांट रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का चयन किया जा सकता है, क्योंकि इसका रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रदर्शन स्पष्ट रूप से एम-एमएलवी सीरीज़ रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की तुलना में बेहतर है, जो विभिन्न आरएनए टेम्प्लेट को कुशलतापूर्वक रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट कर सकता है और आरएनए को सीडीएनए फर्स्ट स्ट्रैंड में अधिकतम सीमा तक ट्रांसक्रिप्ट कर सकता है। सामान्य रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस किट का उपयोग करते समय, 20 μl प्रणाली केवल कुल आरएनए के 1 μg को प्रभावी ढंग से उलट सकती है। कृपया किट की अधिकतम आरटी क्षमता पर ध्यान दें। यदि टेम्पलेट अधिक मात्रा में जोड़ा जाता है, तो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उच्च बहुतायत वाले आरएनए के पक्ष में होगा। इसलिए, यह बेहतर है कि सिस्टम की अधिकतम क्षमता से अधिक न हो।

A-1 निर्धारित करें कि क्या RNA गंभीर रूप से अवक्रमित है और यदि RT सफल है

सामान्य तौर पर, आंतरिक संदर्भ प्रवर्धन की विफलता का कारण अक्सर गंभीर आरएनए गिरावट के कारण होता है। एक अन्य संभावित कारण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन विफलता है। सीडीएनए सिंगल स्ट्रैंड की गुणवत्ता का न्याय करने के लिए आंतरिक संदर्भ का उपयोग मानक के रूप में नहीं किया जा सकता है, लेकिन इसका उपयोग यह निर्धारित करने के लिए मानक के रूप में किया जा सकता है कि आरएनए गुणवत्ता की कोई समस्या नहीं होने पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सफल है या नहीं। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रतिक्रिया दक्षता में सुधार के लिए निरंतर तापमान और निरंतर प्रतिक्रिया प्रणाली बनाए रखना है।

A-2 निर्धारित करें कि क्या आंतरिक संदर्भ जीन को बढ़ाने के लिए प्राइमर विश्वसनीय हैं और यदि पीसीआर में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों के साथ कोई समस्या है।

सापेक्ष मात्रा का ठहराव के लिए, आरएनए को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से पहले मात्राबद्ध किया जाना चाहिए, जो कि कई रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट में भी आवश्यक है, उदाहरण के लिए, आरएनए इनपुट को 1 माइक्रोग्राम के रूप में निर्धारित करें। चूंकि रिवर्स ट्रांसकोडेड सीडीएनए एक मिश्रित समाधान है, जिसमें आरएनए, ओलिगो डीटी, एंजाइम, डीएनटीपी, और यहां तक ​​​​कि थोड़ा डीएनए अवशेष भी शामिल है, विचलन का कारण होगा, इसलिए सीडीएनए को सटीक रूप से मापना असंभव है। इसलिए, आरएनए मात्रा का ठहराव आवश्यक है। यह देखते हुए कि विभिन्न नमूनों में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन दक्षता समान है, प्राप्त सीडीएनए की मात्रा समान होनी चाहिए, और मात्रात्मक विश्लेषण कुल आरएनए की समान मात्रा में विभिन्न जीनों के अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना दिखा सकता है। सापेक्ष प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर का प्रदर्शन करते समय, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद मात्रात्मक सीडीएनए की आवश्यकता नहीं हो सकती है क्योंकि आंतरिक संदर्भ जीन को संदर्भ के रूप में कार्य किया जा सकता है।

यह मुख्य रूप से जीन से संबंधित है, और अधिकांश जीनों के लिए लंबे टुकड़े का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन संभव नहीं है। सबसे पहले, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की दक्षता पीसीआर की तुलना में बहुत कम है। दूसरे, जीसी समृद्ध क्षेत्र और कई जीनों की माध्यमिक संरचना रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर दोनों को प्रतिबंधित करती है। अंत में, पीसीआर की निष्ठा और प्रवर्धन दक्षता की गारंटी एक ही समय में देना मुश्किल है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की प्रक्रिया में, कोई भी कम कॉपी जीन के लिए लंबा टुकड़ा प्राप्त करने की गारंटी नहीं दे सकता है, खासकर ओलिगो डीटी का उपयोग कर। जहां तक ​​अधिक GC के साथ 5' UTR की बात है, तो यह और भी कठिन है। इसलिए, यह अभी भी यादृच्छिक प्राइमरों के साथ प्रतिलेख को उलटने के लिए एक उचित तरीका है, लक्ष्य टुकड़े में प्राकृतिक दरार साइटों को ढूंढें, खंडों द्वारा बढ़ाना, और फिर प्रतिबंध पाचन और बंधन करना। सामान्य तौर पर, 2 kb से बड़े टुकड़ों को सीधे बढ़ाना मुश्किल है, लेकिन इसे प्राप्त करना हमेशा असंभव नहीं होता है: 1. सबसे पहले, RNA/mRNA की अखंडता की गारंटी दें, और TRIZOL निष्कर्षण को प्राथमिकता दी जाती है। 2.एम-एमएलवी आरटी-पीसीआर किट को सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। एनीलिंग समय बढ़ाएँ और प्रवर्धन प्रक्रिया में चक्र संख्या को ठीक से बढ़ाएँ। वैकल्पिक रूप से, नेस्टेड पीसीआर को लागू किया जा सकता है, या सामान्य पीसीआर प्रवर्धन से पहले उचित रूप से विस्तारित विकृतीकरण और विस्तार समय के साथ पहले एक या दो प्रतिक्रियाओं को अंजाम दिया जा सकता है, जो टुकड़ों को बढ़ाने में मदद कर सकता है। पोलीमरेज़ की निष्ठा पर ध्यान दें। 3. आदर्श परिणाम प्राप्त करने के लिए पीसीआर में लांग टैक का उपयोग किया जा सकता है। 4. प्रोटीन अभिव्यक्ति आवेदन के लिए, उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ लागू किया जाना चाहिए।

TIANGEN द्वारा प्रस्तुत दो प्रकार के रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस हैं: क्वांट/किंग RTase और TIANScript M-MLV। उनके बीच मुख्य अंतर टेम्प्लेट की इनपुट राशि है। क्वांट एक अद्वितीय रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस है, जो मोलोनी मुराइन ल्यूकेमिया वायरस से प्राप्त आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले एम-एमएलवी से अलग है। क्वांट एक नया उच्च दक्षता वाला रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस है जिसे इंजीनियरिंग एस्चेरिचिया कोलाई द्वारा पुनः संयोजक रूप से व्यक्त किया गया है। क्वांट उच्च रिवर्स ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि और उच्च उपज के साथ आरएनए के 50 एनजी-2 माइक्रोग्राम को बढ़ाने के लिए उपयुक्त है। साधारण MMLV या AMV की तुलना में, क्वांट की सबसे बड़ी विशेषता यह है कि इसका RNA टेम्प्लेट के साथ बहुत मजबूत संबंध है और उच्च तापमान विकृतीकरण के बिना ट्रांसक्रिप्ट कॉम्प्लेक्स टेम्प्लेट को उलट सकता है। उच्च GC सामग्री वाले टेम्प्लेट के लिए, रिवर्स दक्षता अधिक होती है। हालांकि, इस रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस में RNase H गतिविधि है, जो सीडीएनए उत्पाद की लंबाई को प्रभावित कर सकती है (<4.5 kb टेम्प्लेट के लिए उपयुक्त)। पारंपरिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए, TIANScript MMLV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की सिफारिश की जाती है। यह RTase एक संशोधित एंजाइम है जिसमें बहुत कमजोर RNase H गतिविधि है, जो लंबे (> 5 kb) सीडीएनए संश्लेषण के लिए उपयुक्त है।

सीडीएनए संश्लेषण और प्रवर्धन के बीच ट्यूब कवर को खोले बिना एक-चरण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर प्रवर्धन एक ही ट्यूब में पूरा किया जाता है, जो संदूषण को कम करने में सहायक होता है। चूंकि प्राप्त किए गए सभी सीडीएनए नमूनों का उपयोग प्रवर्धन के लिए किया जाता है, संवेदनशीलता अधिक होती है, जिसमें कुल आरएनए का न्यूनतम 0.01 पीजी होता है। सफल वन-स्टेप RTPCR के लिए, जीन-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग आमतौर पर सीडीएनए संश्लेषण आरंभ करने के लिए किया जाता है। दो-चरणीय विधि, अर्थात् रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और पीसीआर प्रवर्धन दो चरणों में किया जाता है। सीडीएनए प्राप्त करने के लिए सबसे पहले एक आरएनए टेम्पलेट से रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया जाता है, और प्राप्त सीडीएनए एक या अधिक विभिन्न पीसीआर प्रतिक्रियाओं के अधीन होता है। सीडीएनए के पहले स्ट्रैंड के संश्लेषण को निर्देशित करने के लिए दो-चरणीय विधि ओलिगो (डीटी) या यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग कर सकती है, और एक विशिष्ट नमूने से सभी एमआरएनए जानकारी को रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट कर सकती है।