फास्ट साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन किट

ए-1 टेम्पलेट

टेम्पलेट में प्रोटीन अशुद्धियाँ या Taq अवरोधक, आदि शामिल हैं ——डीएनए टेम्पलेट को शुद्ध करें, प्रोटीन अशुद्धियों को दूर करें या शुद्धिकरण किट के साथ टेम्पलेट डीएनए निकालें।

टेम्पलेट का विकृतीकरण पूर्ण नहीं है ——विकृतीकरण तापमान को उचित रूप से बढ़ाएं और विकृतीकरण समय को लंबा करें।

टेम्प्लेट डिग्रेडेशन ——टेम्पलेट को फिर से तैयार करें।

ए-2 प्राइमर

■ प्राइमरों की खराब गुणवत्ता ——प्राइमर को फिर से संश्लेषित करें।

प्राइमर डिग्रेडेशन ——उच्च सांद्रता वाले प्राइमरों को परिरक्षण के लिए छोटी मात्रा में विभाज्य करें। एकाधिक ठंड और विगलन या लंबे समय तक 4 डिग्री सेल्सियस क्रायोप्रेज़र्व्ड से बचें।

प्राइमरों का अनुचित डिज़ाइन (उदाहरण के लिए प्राइमर की लंबाई पर्याप्त नहीं है, प्राइमरों के बीच डिमर का गठन, आदि) -रीडिज़ाइन प्राइमर (प्राइमर डिमर और सेकेंडरी स्ट्रक्चर के गठन से बचें)

ए-3 मिलीग्राम²⁺एकाग्रता

एमजी²⁺ एकाग्रता बहुत कम है —— उचित रूप से Mg . बढ़ाएँ²⁺ एकाग्रता: Mg . का अनुकूलन करें²⁺ इष्टतम Mg . निर्धारित करने के लिए 0.5 मिमी के अंतराल के साथ 1 मिमी से 3 मिमी तक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला द्वारा एकाग्रता²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट और प्राइमर के लिए एकाग्रता।

ए -4 एनीलिंग तापमान

उच्च एनीलिंग तापमान प्राइमर और टेम्पलेट के बंधन को प्रभावित करता है। ——एनीलिंग तापमान को कम करें और 2 डिग्री सेल्सियस की ढाल के साथ स्थिति को अनुकूलित करें।

ए-5 विस्तार समय

■ लघु विस्तार समय——विस्तार समय बढ़ाएँ।

घटना: नकारात्मक नमूने लक्ष्य अनुक्रम बैंड भी दिखाते हैं।

ए-1 पीसीआर का संदूषण

लक्ष्य अनुक्रम या प्रवर्धन उत्पादों का क्रॉस संदूषण ——ध्यान से नकारात्मक नमूने में लक्ष्य अनुक्रम वाले नमूने को पिपेट न करें या उन्हें अपकेंद्रित्र ट्यूब से बाहर न फैलाएं। मौजूदा न्यूक्लिक एसिड को खत्म करने के लिए अभिकर्मकों या उपकरणों को ऑटोक्लेव किया जाना चाहिए, और संदूषण के अस्तित्व को नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों के माध्यम से निर्धारित किया जाना चाहिए।

अभिकर्मक संदूषण ——अभिकर्मकों को विभाज्य करें और कम तापमान पर स्टोर करें।

ए-2 प्राइमr

एमजी²⁺ एकाग्रता बहुत कम है —— उचित रूप से Mg . बढ़ाएँ²⁺ एकाग्रता: Mg . का अनुकूलन करें²⁺ इष्टतम Mg . निर्धारित करने के लिए 0.5 मिमी के अंतराल के साथ 1 मिमी से 3 मिमी तक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला द्वारा एकाग्रता²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट और प्राइमर के लिए एकाग्रता।

अनुचित प्राइमर डिज़ाइन, और लक्ष्य अनुक्रम में गैर-लक्षित अनुक्रम के साथ समरूपता है। —— प्राइमरों को फिर से डिजाइन करें।

घटना: पीसीआर प्रवर्धन बैंड अपेक्षित आकार के साथ असंगत होते हैं, या तो बड़े या छोटे, या कभी-कभी दोनों विशिष्ट प्रवर्धन बैंड और गैर-विशिष्ट प्रवर्धन बैंड होते हैं।

ए-1 प्राइमर

■ खराब प्राइमर विशिष्टता

—— प्राइमर को फिर से डिजाइन करें।

प्राइमर की सघनता बहुत अधिक है ——विकृतीकरण तापमान को ठीक से बढ़ाएँ और विकृतीकरण समय को लम्बा करें।

ए-2 मिलीग्राम²⁺ एकाग्रता

एमजी²⁺ एकाग्रता बहुत अधिक है ——Mg2+ सांद्रता को ठीक से कम करें: Mg . को ऑप्टिमाइज़ करें²⁺ इष्टतम Mg . निर्धारित करने के लिए 0.5 मिमी के अंतराल के साथ 1 मिमी से 3 मिमी तक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला द्वारा एकाग्रता²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट और प्राइमर के लिए एकाग्रता।

ए-3 थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़

अत्यधिक एंजाइम मात्रा - 0.5 यू के अंतराल पर एंजाइम की मात्रा को उचित रूप से कम करें।

ए -4 एनीलिंग तापमान

एनीलिंग तापमान बहुत कम है - एनीलिंग तापमान को उचित रूप से बढ़ाएं या दो-चरण एनीलिंग विधि अपनाएं

ए-5 पीसीआर चक्र

बहुत अधिक पीसीआर चक्र ——पीसीआर चक्रों की संख्या कम करें।

ए-1 प्राइमर——खराब विशिष्टता ——प्राइमर को फिर से डिज़ाइन करें, इसकी विशिष्टता बढ़ाने के लिए प्राइमर की स्थिति और लंबाई बदलें; या नेस्टेड पीसीआर करें।

A-2 टेम्प्लेट डीएनए

——टेम्पलेट शुद्ध नहीं है ——टेम्पलेट को शुद्ध करें या शुद्धिकरण किट से डीएनए निकालें।

ए-3 मिलीग्राम²⁺ एकाग्रता

——एमजी²⁺ एकाग्रता बहुत अधिक है ——Mg . को ठीक से कम करें²⁺ एकाग्रता: Mg . का अनुकूलन करें²⁺ इष्टतम Mg . निर्धारित करने के लिए 0.5 मिमी के अंतराल के साथ 1 मिमी से 3 मिमी तक प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला द्वारा एकाग्रता²⁺ प्रत्येक टेम्पलेट और प्राइमर के लिए एकाग्रता।

ए-4 डीएनटीपी

——dNTPs की सांद्रता बहुत अधिक है ——dNTP की सांद्रता को उचित रूप से कम करें

ए -5 एनीलिंग तापमान

——बहुत कम एनीलिंग तापमान ——एनीलिंग तापमान को उचित रूप से बढ़ाएं

ए-6 चक्र

——बहुत सारे चक्र ——चक्र संख्या को अनुकूलित करें

पहला कदम उपयुक्त पोलीमरेज़ चुनना है। नियमित टाक पोलीमरेज़ 3'-5' एक्सोन्यूक्लिज़ गतिविधि की कमी के कारण प्रूफरीड नहीं कर सकता है, और बेमेल टुकड़ों की विस्तार दक्षता को बहुत कम कर देगा। इसलिए, नियमित टाक पोलीमरेज़ 5 केबी से बड़े लक्ष्य अंशों को प्रभावी ढंग से नहीं बढ़ा सकता है। विस्तार दक्षता में सुधार और लंबे टुकड़े के प्रवर्धन की जरूरतों को पूरा करने के लिए विशेष संशोधन या अन्य उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ के साथ टाक पोलीमरेज़ का चयन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, लंबे टुकड़ों के प्रवर्धन के लिए भी प्राइमर डिजाइन, विकृतीकरण समय, विस्तार समय, बफर पीएच, आदि के अनुरूप समायोजन की आवश्यकता होती है। आमतौर पर, 18-24 बीपी वाले प्राइमर बेहतर उपज दे सकते हैं। टेम्पलेट क्षति को रोकने के लिए, ९४ डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण का समय प्रति चक्र ३० सेकंड या उससे कम होना चाहिए, और प्रवर्धन से पहले तापमान को ९४ डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाने का समय १ मिनट से कम होना चाहिए। इसके अलावा, विस्तार तापमान को लगभग 68 डिग्री सेल्सियस पर सेट करना और 1 केबी/मिनट की दर के अनुसार विस्तार समय को डिजाइन करना लंबे टुकड़ों के प्रभावी प्रवर्धन को सुनिश्चित कर सकता है।

उच्च निष्ठा के साथ विभिन्न डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन की त्रुटि दर को कम किया जा सकता है। अब तक पाए गए सभी टाक डीएनए पोलीमरेज़ में, पीएफयू एंजाइम की त्रुटि दर सबसे कम और उच्चतम निष्ठा है (संलग्न तालिका देखें)। एंजाइम चयन के अलावा, शोधकर्ता प्रतिक्रिया की स्थिति को अनुकूलित करके पीसीआर उत्परिवर्तन दर को और कम कर सकते हैं, जिसमें बफर संरचना का अनुकूलन, थर्मोस्टेबल पोलीमरेज़ की एकाग्रता और पीसीआर चक्र संख्या का अनुकूलन शामिल है।