टियांसेक एंड रिपेयर/डीए-टेलिंग मॉड्यूल

वर्तमान में, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण तकनीक मुख्य रूप से अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक पर आधारित है। चूंकि अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक की पढ़ने की लंबाई सीमित है, इसलिए हमें अनुक्रम के लिए पूर्ण लंबाई अनुक्रम को छोटे खंड पुस्तकालयों में तोड़ना होगा। विभिन्न अनुक्रमण प्रयोगों की आवश्यकताओं के अनुसार, हम आमतौर पर सिंगल-एंडेड सीक्वेंसिंग या डबल-एंडेड सीक्वेंसिंग चुनते हैं। वर्तमान में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय के डीएनए टुकड़े आमतौर पर 200-800 बीपी की सीमा में वितरित किए जाते हैं।

ए) डीएनए गुणवत्ता में खराब है और इसमें अवरोधक होते हैं। एंजाइम गतिविधि के निषेध से बचने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए नमूनों का उपयोग करें।

बी) डीएनए पुस्तकालय के निर्माण के लिए पीसीआर-मुक्त पद्धति का उपयोग करते समय डीएनए नमूने की मात्रा अपर्याप्त है। जब खंडित डीएनए का इनपुट 50 एनजी से अधिक हो जाता है, तो पुस्तकालय निर्माण प्रक्रिया के दौरान पीसीआर-मुक्त कार्यप्रवाह को चुनिंदा रूप से किया जा सकता है। यदि पुस्तकालय की प्रतिलिपि संख्या सीधे अनुक्रमित करने के लिए बहुत कम है, तो डीएनए पुस्तकालय को एडेप्टर बंधाव के बाद पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जा सकता है।

सी) आरएनए संदूषण से प्रारंभिक डीएनए परिमाणीकरण गलत हो जाता है जीनोमिक डीएनए की शुद्धि प्रक्रिया में आरएनए संदूषण मौजूद हो सकता है, जिससे पुस्तकालय निर्माण के दौरान गलत डीएनए परिमाणीकरण और अपर्याप्त डीएनए लोडिंग हो सकती है। RNase से उपचार करके RNA को हटाया जा सकता है।

एक-1

ए) छोटे टुकड़े (६० बीपी-१२० बीपी) दिखाई देते हैं छोटे टुकड़े आमतौर पर एडेप्टर के टुकड़े या एडेप्टर द्वारा बनाए गए डिमर होते हैं। Agencourt AMPure XP चुंबकीय मोतियों के साथ शुद्धिकरण इन एडेप्टर अंशों को प्रभावी ढंग से हटा सकता है और अनुक्रमण गुणवत्ता सुनिश्चित कर सकता है।

बी) पीसीआर प्रवर्धन के बाद पुस्तकालय में बड़े टुकड़े दिखाई देते हैं एडेप्टर लिगेट होने के बाद पुस्तकालय डीएनए टुकड़े का आकार 120 बीपी बढ़ जाएगा। यदि एडेप्टर बंधाव के बाद डीएनए टुकड़ा 120 बीपी से अधिक बढ़ जाता है, तो यह अत्यधिक पीसीआर प्रवर्धन के असामान्य खंड प्रवर्धन के कारण हो सकता है। पीसीआर साइकिलों की संख्या कम करने से स्थिति को रोका जा सकता है।

ग) एडेप्टर लिगेशन के बाद पुस्तकालय डीएनए के टुकड़ों का असामान्य आकार इस किट में एडेप्टर की लंबाई 60 बीपी है। जब टुकड़े के दो सिरों को एडेप्टर से जोड़ा जाता है, तो लंबाई केवल १२० बीपी बढ़ जाएगी। इस किट द्वारा प्रदान किए गए एडेप्टर के अलावा किसी अन्य एडेप्टर का उपयोग करते समय, कृपया प्रासंगिक जानकारी प्रदान करने के लिए आपूर्तिकर्ता से संपर्क करें जैसे कि एडेप्टर की लंबाई। कृपया सुनिश्चित करें कि प्रयोग कार्यप्रवाह और संचालन मैनुअल में वर्णित चरणों का पालन करते हैं।

डी) एडेप्टर लिगेशन से पहले असामान्य डीएनए टुकड़ा आकार इस समस्या का कारण डीएनए विखंडन के दौरान गलत प्रतिक्रिया की स्थिति के कारण हो सकता है। अलग-अलग डीएनए इनपुट के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया समय का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यदि डीएनए इनपुट १० एनजी से अधिक है, तो हम अनुकूलन के लिए शुरुआती समय के रूप में १२ मिनट के प्रतिक्रिया समय को चुनने की सलाह देते हैं, और इस समय उत्पादित टुकड़े का आकार मुख्य रूप से ३००-५०० बीपी की सीमा में है। उपयोगकर्ता आवश्यक आकार के साथ डीएनए अंशों को अनुकूलित करने के लिए अपनी आवश्यकताओं के अनुसार 2-4 मिनट के लिए डीएनए अंशों की लंबाई बढ़ा या घटा सकते हैं।

एक -2

ए) विखंडन समय अनुकूलित नहीं है यदि खंडित डीएनए बहुत छोटा या बहुत बड़ा है, तो कृपया प्रतिक्रिया समय निर्धारित करने के निर्देश में प्रदान किए गए विखंडन समय चयन के लिए दिशानिर्देश देखें, और इस समय बिंदु को नियंत्रण के रूप में उपयोग करें, इसके अतिरिक्त एक सेट अप करें विखंडन समय पर अधिक सटीक समायोजन करने के लिए 3 मिनट को लम्बा या छोटा करने के लिए प्रतिक्रिया प्रणाली।

एक-3

विखंडन उपचार के बाद डीएनए का असामान्य आकार वितरण

ए) विखंडन अभिकर्मक की गलत विगलन विधि, या अभिकर्मक विगलन के बाद पूरी तरह से मिश्रित नहीं है। बर्फ पर 5 × विखंडन एंजाइम मिक्स रिएजेंट को गल लें। एक बार गल जाने के बाद, ट्यूब के निचले हिस्से को धीरे से हिलाकर अभिकर्मक को समान रूप से मिलाएं। अभिकर्मक भंवर मत करो!

बी) डीएनए इनपुट नमूने में ईडीटीए या अन्य प्रदूषक शामिल हैं डीएनए शुद्धिकरण चरण में नमक आयनों और चेलेटिंग एजेंटों की कमी प्रयोग की सफलता के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। यदि डीएनए 1×TE में घुल जाता है, तो विखंडन करने के लिए निर्देश में दी गई विधि का उपयोग करें। यदि समाधान में EDTA एकाग्रता अनिश्चित है, तो डीएनए को शुद्ध करने और बाद की प्रतिक्रिया के लिए इसे विआयनीकृत पानी में घोलने की सिफारिश की जाती है।

सी) गलत प्रारंभिक डीएनए मात्रा का ठहराव खंडित डीएनए का आकार डीएनए इनपुट की मात्रा से निकटता से संबंधित है। विखंडन उपचार से पहले, प्रतिक्रिया प्रणाली में डीएनए की सटीक मात्रा निर्धारित करने के लिए क्यूबिट, पिकोग्रीन और अन्य विधियों का उपयोग करके डीएनए की सटीक मात्रा का ठहराव आवश्यक है।

 डी) प्रतिक्रिया प्रणाली की तैयारी निर्देशों का पालन नहीं करती है खंडित प्रतिक्रिया प्रणाली की तैयारी निर्देशों के अनुसार सख्ती से बर्फ पर की जानी चाहिए। सर्वोत्तम प्रभाव सुनिश्चित करने के लिए, सभी प्रतिक्रिया घटकों को बर्फ पर रखा जाना चाहिए और प्रतिक्रिया प्रणाली की तैयारी पूरी तरह से ठंडा होने के बाद की जानी चाहिए। तैयारी पूरी होने के बाद, कृपया अच्छी तरह मिलाने के लिए फ्लिक या पिपेट करें। भंवर मत करो!

1. अनुचित मिश्रण विधि (भंवर, हिंसक दोलन, आदि) पुस्तकालय के टुकड़ों के असामान्य वितरण का कारण बनेगी (जैसा कि निम्नलिखित आकृति में दिखाया गया है), इस प्रकार पुस्तकालय की गुणवत्ता को प्रभावित करता है। इसलिए, फ्रैग्मेंटेशन मिक्स रिएक्शन सॉल्यूशन तैयार करते समय, कृपया मिश्रण करने के लिए धीरे से ऊपर और नीचे पिपेट करें, या फ़्लिक करने और समान रूप से मिलाने के लिए उंगलियों का उपयोग करें। सावधान रहें कि भंवर के साथ मिश्रण न करें।

2. पुस्तकालय निर्माण के लिए उच्च शुद्धता वाले डीएनए का उपयोग किया जाना चाहिए

■ अच्छा डीएनए अखंडता: वैद्युतकणसंचलन बैंड बिना पूंछ के 30 kb से अधिक है

ओडी २६०/२३०: >१.५

OD260/280: 1.7-1.9

3. डीएनए इनपुट राशि सटीक होनी चाहिए। नैनोड्रॉप के बजाय डीएनए को मापने के लिए क्यूबिट और पिकोग्रीन विधियों का उपयोग करने का सुझाव दिया गया है।

4. डीएनए समाधान में EDTA की सामग्री निर्धारित की जानी चाहिए EDTA का विखंडन प्रतिक्रिया पर बहुत प्रभाव पड़ता है। यदि ईडीटीए की सामग्री अधिक है, तो बाद के परीक्षण से पहले डीएनए शुद्धिकरण किया जाना चाहिए।

5. विखंडन प्रतिक्रिया समाधान बर्फ पर तैयार किया जाना चाहिए विखंडन प्रक्रिया प्रतिक्रिया तापमान और समय (विशेषकर बढ़ाने के बाद) के प्रति संवेदनशील है। प्रतिक्रिया समय की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए, कृपया बर्फ पर प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करें।

6. विखंडन प्रतिक्रिया समय सटीक होना चाहिए विखंडन चरण की प्रतिक्रिया समय सीधे खंड उत्पादों के आकार को प्रभावित करेगा, इस प्रकार पुस्तकालय में डीएनए अंशों के आकार वितरण को प्रभावित करेगा।

1. इस किट पर किस प्रकार का नमूना लागू है?

इस किट का लागू नमूना प्रकार अच्छी आरएनए अखंडता के साथ कुल आरएनए या शुद्ध एमआरएनए हो सकता है। यदि पुस्तकालय के निर्माण के लिए कुल आरएनए का उपयोग किया जाता है, तो पहले आरआरएनए को हटाने के लिए आरआरएनए रिक्तीकरण किट (कैट #४९९२३६३/४९९२३६४/४९९२३९१) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

2. क्या इस किट के साथ पुस्तकालय के निर्माण के लिए एफएफपीई नमूनों का उपयोग किया जा सकता है?

एफएफपीई नमूनों में एमआरएनए कुछ हद तक खराब हो जाएगा, सापेक्ष खराब अखंडता के साथ। पुस्तकालय निर्माण के लिए इस किट का उपयोग करते समय, विखंडन समय को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है (विखंडन समय को छोटा करना या विखंडन नहीं करना)।

3. उत्पाद मैनुअल में प्रदान किए गए आकार चयन चरण का उपयोग करते हुए, सम्मिलित किए गए खंड में थोड़ा विचलन दिखाई देने का क्या कारण हो सकता है?

आकार चयन इस उत्पाद मैनुअल में आकार चयन चरण के अनुसार सख्ती से किया जाएगा। यदि विचलन होता है, तो इसका कारण यह हो सकता है कि चुंबकीय मोती कमरे के तापमान के लिए संतुलित नहीं हैं या पूरी तरह मिश्रित नहीं हैं, पिपेट सटीक नहीं है या तरल टिप में रहता है। प्रयोग के लिए कम सोखना वाले सुझावों का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।

4. पुस्तकालय निर्माण में एडेप्टर का चयन

पुस्तकालय निर्माण किट में एडेप्टर अभिकर्मक नहीं होता है, और इस किट का उपयोग TIANSeq सिंगल-इंडेक्स एडेप्टर (इलुमिना)(४९९२६४१/४९९२६४२/४९९२३७८) के साथ करने की अनुशंसा की जाती है।

5. पुस्तकालय का क्यूसी

लाइब्रेरी क्वांटिटेटिव डिटेक्शन: क्यूबिट और क्यूपीसीआर का इस्तेमाल क्रमशः लाइब्रेरी की मास कंसंट्रेशन और मोलर कंसंट्रेशन को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। ऑपरेशन सख्ती से उत्पाद मैनुअल के अनुसार है। पुस्तकालय की एकाग्रता आम तौर पर एनजीएस अनुक्रमण की आवश्यकताओं को पूरा करेगी। पुस्तकालय वितरण रेंज का पता लगाना: पुस्तकालय वितरण रेंज का पता लगाने के लिए Agilent 2100 Bioanalyzer का उपयोग करना।

6. प्रवर्धन चक्र संख्या का चयन

निर्देशों के अनुसार, पीसीआर चक्रों की संख्या 6-12 है, और आवश्यक पीसीआर चक्रों की संख्या नमूना इनपुट के अनुसार चुनी जानी चाहिए। उच्च-उपज वाले पुस्तकालयों में, ओवर एम्प्लीफिकेशन आमतौर पर अलग-अलग डिग्री में होता है, जो एगिलेंट 2100 बायोएनालिज़र का पता लगाने में लक्ष्य सीमा के शिखर के बाद थोड़ा बड़ा शिखर द्वारा प्रकट होता है, या क्यूबिट की ज्ञात एकाग्रता qPCR की तुलना में कम है। माइल्ड ओवर एम्प्लीफिकेशन एक सामान्य घटना है, जो पुस्तकालय अनुक्रमण और बाद के डेटा विश्लेषण को प्रभावित नहीं करती है।

7. स्पाइक्स Agilent 2100 Bioanalyzer . के डिटेक्शन प्रोफाइल में दिखाई देते हैं

Agilent 2100 Bioanalyzer डिटेक्शन में स्पाइक्स की उपस्थिति नमूनों के असमान विखंडन के कारण है, जहां निश्चित आकार में अधिक टुकड़े होंगे, और यह पीसीआर संवर्धन के बाद और अधिक स्पष्ट हो जाएगा। इस मामले में, यह सुझाव दिया जाता है कि आकार का चयन न करें, यानी 15 मिनट के लिए विखंडन की स्थिति को ९४ डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, जहां टुकड़ा वितरण छोटा और केंद्रित है, और एकरूपता में सुधार किया जा सकता है।